【AD】Aβ诱导AD动物模型评价方案

一、动物模型命名

侧脑室注射人β-淀粉样多肽（1-42)诱导AD模型

二、模型制备规范（环境、设备、操作程序、实验操作规程）

SPF级SD大鼠称重，2%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔内注射麻醉。麻醉后继而将大鼠头部固定于脑立体定位仪上。剪去局部毛发，消毒后沿矢状线切开皮肤，切口长约1.5cm,将骨膜向两侧推开显露头骨。按照大鼠脑立体定位图谱，以前囟为零起点，前囟后3.5 mm处为穿刺点，中线右侧旁开2mm，而后颅钻钻开颅骨，采用微量注射器自脑表面垂直进针3mm，即：(AP= -3.5 mm, ML=2.0 mm, DV=3.0 mm)，双侧海马CA1区缓慢匀速注射Aβ1-42各10 μg (1 μL)，留针5 min，使药物充分扩散，缓慢退针5min，无菌骨蜡封闭钻孔，术区滴注庆大霉素，缝合伤口消毒。

三、模型评价方法与指标体系（该模型制备采用的生理、生化和病理方法，包括行为、影像、生理生化和组织切片等技术设备，仪器设备满足模型评价的要求，指标完善，条件稳定。）

1、手术24小时后对大鼠进行神经功能学评分参照评分标准功能正常时得分最高为18分，功能损伤最严重得分最低为3分，最终将得分低于17分的大鼠并且有明显、偏瘫行动障碍的大鼠剔除。

①自主运动

大鼠置于普通环境鼠笼中观察5分钟根据其触及鼠笼四壁的能力为其自主运动评分，评分标准如下：大鼠在环境中正常运动并至少触及三侧笼壁为3分，对大鼠运动有轻微影响以至于大鼠在鼠笼中有运动迟缓但至少触及侧笼壁为2分，对大鼠运动有严重影响，以至于大鼠在鼠笼中无法站立，很少运动的为1分，大鼠完全不能运动的为0分。

②四肢运动的对称性

提起大鼠尾部使之悬空观察四肢状态评分标准如下四肢对称正常伸展为3分，左侧肢伸展幅度不如右侧肢灵敏度亦不如的为2分，左侧肢只有轻微运动的为1分，左前肢无运动的为0分。

③前肢伸展运动

悬尾使后肢悬空前肢移向桌子边缘使之仅靠前肢行走，观察前肢伸展运动的对称性评分标准如下：双侧前肢正常伸展对称且大鼠仅靠前肢行走动作协调致的为3 分；大鼠左侧肢伸展不如右侧前肢行走有困难的为2分；左前肢很少运动的为1 分；左前肢完全不运动的为0分。

④攀爬能力

将大鼠放置在铁丝笼壁上大鼠将四肢并用攀爬上笼壁当实验者拉住它的尾巴，将它从铁丝笼壁上拉下来时记录抓力评分标准如下：大鼠正常爬行，拉离时抓力大 的为3分，爬行时左侧肢损伤或拉离时左侧肢抓力不如右侧肢的为2分，大鼠无法爬行或原地转圈的为1分。

⑤ 两侧身体触觉反射

用根纯的木棍触碰大鼠身体的两侧观察大鼠的反应，评分标准如下：刺激两侧时大鼠均转头且受惊程度相同为3分，左侧反应弱于右侧为2分，刺激左侧，大鼠无反应的为1分。

⑥ 两侧胡须触觉反射

用1根钝的木棍从大鼠后方项大鼠胡须以避免动作进入视觉领域；触碰大鼠胡须观察大鼠反应评分标准如下：刺激两侧时大鼠均转头且受惊程度相同为3分，左侧反应弱于右侧为2分，刺激左侧无反应为1分。

2、Morris水迷宫法检测

行为学检测：进行Morris水迷宫试验，试验分为定位航行实验和空间探索实验。

定位航行实验：大鼠连续接受5天的训练，每天4次，每次时间间隔30min，记录下大鼠从4个入水点和入水并找到平台所需要的时间，即逃避潜伏期。4次潜伏期的平均成绩作为当日的最终结果进入到最后统计。

空间探索实验：实验的第6天，撤去平台，从距离平台的最远端入水后，将大鼠放入水中，记录下30s内大鼠的游泳轨迹，并观察分析大鼠穿越原平台所在位置的次数。

 

大鼠学习记忆能力检测时间点大鼠分别在分组前1周造模后第1、2、4周进行 Morris水迷宫实验其中包括定位航行实验和空间探索实验两部分。

Morris水迷宫由圆形水池，圆形透明平台、摄像机、电脑分析系统。组成圆形水池直径为130cm，高50cm，池壁上标有东西南北四个入水点，将水池平分为四个象限分别为Ｉ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，在第Ｉ象限正中离池壁33cm处放置直径为9cm、高29cm的圆形大鼠平台实验前将水注入池中，水深30cm（水面高出站台表面1cm）,水温保持在24±1℃，室内保持绝对安静以恒定白炽灯照明亮度保持均匀水池周边挂有参照物保持位置不变水迷宫上方安装自动摄像机同步记录大鼠运动轨迹，数据采集和处理由Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成。

①定位航行实验测量大鼠获取经验(学习)的能力

实验前天下午将大鼠放入水中适应2min 使其熟悉实验环境正式实验历时2.5天每天分上下午两个时段各训练1次,1-5号位为大鼠不同的入水点，将大鼠朝向池壁放入同一次训练所有大鼠入水点相同设定潜伏期上限为120s记录各组大鼠找到平台的时间即逃避潜伏期(escape latency)如果大鼠在120s内未找到平台需将其引至平台并停留10s以强化记忆这时逃避潜伏期记为120s。

②第3天下午撤除平台，将大鼠在第4入水点面向池壁放入水池记录大鼠穿越原平台所在位置的次数作为空间探索能力的指标。

四、模型的安全性评价（监督管理、处置措施、微生物菌株管理、细胞系描述、遗传分析、对环境和生态影响评估等。）

模型使用的人β-淀粉样多肽(1-42)是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲，对机体组织毒性相对较小，动物存活率高，是国内外使用较多的制备AD动物模型的药物。

五、有助于动物模型鉴定和评价的其它材料（如影响模型制备、实验操作的注意事项，以及对造模的成功率、成活时间、死亡率的影响等。）

模型的水迷宫测试，每天在固定的时间测试，操作轻柔，避免不必要的应激刺激。