【MCAO】光化学栓塞法建立缺血性脑卒中动物模型

1  实验器材

干棉球、酒精棉球、75%酒精、碘伏，生理盐水、注射器（1ml）、黑色记号笔、固定大鼠用自制拉钩、铺巾。手术器械：剃毛器，体温维持仪，立体定位仪，台式显微镜，眼科剪、弯镊、缝合线、缝合针。561 mm 黄绿光激光器（型号：R-LG561-100-A5,生产厂家：瑞沃德公司）。

 

2  实验试剂

玫瑰红 （Sigma Aldrich, Steinheim, D）

麻醉剂：3%戊巴比妥钠

 

3  造模步骤

3.1 SD大鼠称重，3%戊巴比妥钠（35mg/kg）麻醉。使用镊子夹足，测试麻醉的深度，当呼吸平缓，无压足缩回反应时，说明进入实验麻醉中期，从眼间至颈部剔除头顶部被毛，用碘伏消毒头顶部皮肤。

 

3.2矢正中纵向剪开头顶皮肤暴露颅骨，剥离颅骨表面结缔组织膜并用不锈钢刮刀休整。

 

3.3以bregma点为基准原点，于矢状缝左侧2.0mm、冠状缝后2.0mm处为卒中模型窗口。在解剖镜下用高速颅骨钻，打磨暴露的颅骨但保持硬膜完整。用无菌压缩空气吹去打磨的骨粉，用不锈钢刮刀轻柔修整打磨面，直到滴加PBS可见清晰大脑浅表血管为止。

 

3.4 腹腔内注射玫瑰红（100 mg/kg），立即将大鼠置于落射荧光显微镜下，使用绿色激发光定点照射磨薄颅骨处，控制照射面积为1mm²照射时间2min以激发染料反应，使用红色激发光定点照射，建模成功。

3.5 缝合小鼠头部皮肤，置于加热板上恒温保温至完全清醒后放回鼠笼，与未做手术的小鼠隔离饲养。

4  模型评判标准

4.1 尼氏染色梗死面积测定：

造模鼠麻醉后，心室灌流固定取脑，4%多聚甲醛固定72 h，切片机切成30μm的冠状切片，每120μm取1片，空气干燥5-15min，95%乙醇浸泡15min，70%乙醇浸泡1min，50%乙醇浸泡1min，双蒸水浸泡1min，甲酚紫溶液浸泡10min，双蒸水浸泡1min，50%乙醇浸泡1min，70%乙醇浸泡2min，95%乙醇浸泡2min，100%乙醇浸泡2min，二甲苯浸泡10min，中性树胶封固，光镜观察尼氏染色结果。深蓝色为正常组织，淡蓝色为梗死区域。

采用Loihl等发现的公式计算梗死体积，梗死体积=对侧大脑的体积-同侧未损伤大脑的体积。

4.2 Fluoro-Jade C染色：该染色法可染色所有退化神经元。

大鼠脑切片自然晾干；切片首先浸入1% NaOH-80%乙醇混合液浸泡5 min，转入70%乙醇浸泡2 min，然后在蒸馏水中浸泡2 min；继而浸入0.06%高锰酸钾溶液浸泡10 min(室温)，后转入蒸馏水中洗2 min；将0.000 1% Fluoro-Jade C染液(含0.1%的乙酸)均匀滴加到处理后的脑切片上，反应10 min(室温)，反应时应尽量避免强光照射；反应后的切片在蒸馏水中漂洗3次，每次1 min；晾干，透明(二甲苯1 min)，用中性树胶封固。荧光显微镜下采用蓝色滤色片(激发光波长为450-490 nm) 观察并采集图像。