【PD】6-羟基多巴胺致帕金森病大鼠模型

1  实验器材

电热压力蒸汽灭菌器；微量电子天平；电热恒温鼓风干燥箱；水平电泳仪；电热蒸馏水器；20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL可调微量加样枪；手术器械：眼科剪、解剖剪、蚊式钳、有齿镊、无齿镊。

2  实验试剂

本实验动物选用成年健康大鼠，体重180～220g，7月龄，雌雄各半，经反复检测无异常旋转行为。动物自由饮食，室温22～25℃。6-OHDA 溶于0.2％抗坏血酸生理盐水中，使用时从-20℃中取出，置于冰上，避光，30分钟内用完。

3  造模步骤

3.1 麻醉，大鼠术前禁食12h。实验组动物用戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉，待其出现麻醉症状后再进行手术操作。

3.2 立体定位，将大鼠腹位、四肢外展，用橡皮筋将其固定于立体定位仪上，呈俯卧位。将大鼠舌头轻轻拉向一边尽量保持呼吸通畅。

3.3 常规消毒，切开头皮和皮下组织，钝性分离颅骨外膜，充分暴露前囟及右侧颅骨。将齿棒设定为2.4mm，确定前囟坐标。根据包新民所著《大鼠脑立体定位图谱》，确定右侧纹状体两个注射点的坐标。第一点为前囟前1.0mm，矢状缝右侧3.0mm，硬膜下4.5mm；第二点为前囟后1.0mm，矢状缝右侧4.5mm，硬膜下6.0mm。

3.4 在上述选定的坐标点用微型磨钻钻颅，用微量注射器将2 μg/μL的6-OHDA 5 μL分别注入实验组动物的上述两点，注射速度为1 μL /min，注毕留针10min，退针速度为1mm/min，以防药液溢出。

3.5 退针后常规缝合头皮，术毕腹腔注射青霉素10万U/100g。对照组在上述右侧纹状体的两点注射入0.2％抗坏血酸生理盐水5μL，其余处理同实验组。苏醒后两组动物均在同一环境下饲喂。

3.6 旋转行为检测  分别在术后1周、2周、4周、6周、8周和10周于颈部皮下注射0.1％阿扑吗啡(apomorphine, APO; 1mL/kg)，诱发大鼠向健侧的单向旋转行为，PD模型旋转检测仪记录动物向对侧旋转情况，旋转360°为1次，每次记录30min。

4  模型评判标准

4.1 造模后一般变化 分别在术后1周、2周、4周、6周、8周和10周于颈部皮下注射0.1％阿扑吗啡(apomorphine, APO; 1mL/kg)，诱发大鼠向健侧的单向旋转行为，PD模型旋转检测仪记录动物向对侧旋转情况，旋转360°为1次，每次记录30min。一般认为，平均旋转次数≥7转/min为成功的PD大鼠模型。除旋转行为外，还需注意观察是否伴有震颤、活动迟缓、抓握、嗅探等异常行为。

4.2 造模后生化及病理变化

(1)免疫组织化学观测：PD模型大鼠左侧中脑黑质区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)反应阳性神经元较右侧明显减少，与对照组的左侧和右侧比较均有极显著差异，而PD模型大鼠的右侧TH反应阳性神经元与对照组无明显差异。术后2周、3周、4周、6周的成功PD模型鼠TH反应阳性神经元与术后1周相比明显减少，术后3周、4周、6周同术后2周比较亦有显著差异，而术后3周、4周、6周的TH反应阳性神经元之间则无明显差异。

(2)电镜观察：透射电镜下可见PD模型鼠损伤侧黑质区部分神经元变性坏死，胞膜破裂或残缺，核仁破裂。部分神经元细胞质内溶酶体增多，线粒体和内质网轻度增生，胞核固缩不明显，呈早期凋亡样改变。一部分神经元则出现染色质致密或凝固成边界清晰的块状物，有些出现细胞器水肿，胞膜不清晰及皱缩，细胞质内有电子致密物沉积，溶酶体消失，表现为晚期凋亡样改变。

5  操作注意事项

5.1 实验时选用大鼠体重尽量在要求范围内，选择体重在180～250g的大鼠，这类大鼠耐受力强，头部易被脑立体定位仪固定； 麻醉剂量严格控制在30-50mg/kg，避免麻醉过量。

5.2 黑质靶点的确定，应根据所用的定向图谱及立体定向仪认真调整验证；

5.3 6-OHDA应新鲜配制，颜色以橙红色为准；注药速度与留针也很重要；

5.4 手术器械严格消毒，防止手术感染，手术创伤应尽可能小，严格无菌操作；

5.5颅骨钻孔时应注意深浅，一旦有突破感立即停止，防止引起大量出血；微量注射器的针尖部要稍微磨钝，以缩小药剂渗透的范围。

5.6 SD大鼠在造模后，一定注意保温、吸痰。根据大鼠的夜间习性，下午或晚上造模的成活率更高些。